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| 一种带有安全标记基因的基因无痕编辑的载体及其应用 摘 要 近几十年来，随着分子生物学和基因组测序技术的不断发展，为了能够利用已有的基因组信息和分子生物学方法实现对基因组的定向编辑，所以迫切需要一种快速、无痕、高效的基因编辑工具。 传统的基因敲除系统主要是利用双向筛选系统，需要两次转化的过程。首先将带有目的基因和标记基因的核酸片段转入细胞，通过同源重组替换靶基因组。然后将含有插入位点上下游同源序列的核酸片段转化进入细胞，通过同源重组删除抗性标记基因。 标记基因在遗传转化中筛选和鉴定转化的重组子，常用的标记基因主要有两种：抗生素类标记基因和除草剂类标记基因。标记基因的使用在不仅对邻近基因及其目的基因表达产生影响，同时还将造成潜在的生态环境安全性问题和食用安全性问题。根据标记基因的安全性及无痕编辑等要求，通常需要在完成所需的基因编辑后删除标记基因。因此，对生物安全性标记基因的研究显得非常重要。生物安全性标记基因的优点主要在于标基因副作用，且有利于标记基因的回收和重复使用，从而提高了转化效率。 本研究利用分子内基因同源重组原理，通过在目的基因两端串联并行重复序列的方法，实现了一步转化两步重组完成基因编辑的过程。相对于传统的基因编辑方法(需要两次转化)，由于本试验提供的方法只需要一次转化就可以实现预期的改造和双向筛选标记基因的删除，因此在很大程度上简化了基因编辑的操作步骤。主要过程如下： a.设计和构建的核酸片段在其两端含有与待修饰位点的上游和下游同源的序列，所述片段在转化到细胞中之后能够与靶基因发生同源重组，所述核酸片段整合到靶位点上，将待修饰位点的基因或碱基删除、替换待修饰位点的基因或碱基、或者插入到待修饰位点。 b.在发生上述第一步的同源重组之后，通过正筛选富集重组子。 c.在正筛选之后，需要去除标记基因。利用两个并行重复序列之间的同源重组剔除标记基因。经YPGal合成培养基平板反向筛选，使含有同源臂片段的Gal-CWP1基因序列再次发生同源重组，丢失GAL-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。 关键词：酿酒酵母；细胞壁；CWP1；基因无痕编辑 |
